Spektrofotometrai tapo moderniomis molekulinės biologijos laboratorijose. Dažnai naudojami nukleino rūgščiai, baltymų kiekybiniam nustatymui ir bakterijų augimo koncentracijų kiekybiniam nustatymui.
Paprastas spektrofotometro principas
Spektrofotometras naudoja šviesos šaltinį, kuris gali generuoti kelis bangos ilgius, ir eina per spektrinius įrenginius, kad sukurtų tam tikro bangos ilgio šviesos šaltinį. Kai šviesos šaltinis praeina per bandomąjį mėginį, dalis šviesos šaltinio yra absorbuojama ir apskaičiuojama mėginio sugeriamumas, taip paverčiant mėginio koncentracija. . Mėginio absorbcija yra proporcinga mėginio koncentracijai.
Nukleino rūgščių kiekybinis nustatymas
Nukleino rūgščių kiekybinis nustatymas yra dažniausiai naudojama spektrofotometro funkcija. Oligonukleotidai, vienos grandinės, dvigubos DNR ir RNR gali būti kiekybiškai nustatyti buferyje. Didžiausios nukleino rūgšties absorbcijos smailės absorbcijos smailė yra 260 nm. Kiekvienos nukleino rūgšties molekulinė sudėtis yra skirtinga, todėl perskaičiavimo koeficientai yra skirtingi. Norint nustatyti įvairių tipų nukleorūgštis, iš anksto pasirinkite atitinkamus koeficientus. Pavyzdžiui, 1 OD absorbcija atitinka 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNR ir 30 μg / ml Olig. Absorbcija po bandymo konvertuojama aukščiau nurodytais koeficientais, kad gautų atitinkamą mėginio koncentraciją. Prieš atlikdami bandymus, pasirinkite tinkamą procedūrą, įveskite pradinio tirpalo ir skiediklio tūrį, o tada išbandykite tuščią ir mėginio tirpalą. Tačiau eksperimentas ne visada buvo lygus. Nestabilūs rodmenys gali būti didžiausias eksperimento galvos skausmas. Prietaisai, turintys didesnį jautrumą, rodo didesnį absorbciją.
Iš tiesų, spektrofotometro projektavimo principas ir veikimo principas leidžia absorbcijai tam tikru intervalu kisti, ty prietaisas turi tam tikrą tikslumą ir tikslumą. Pavyzdžiui, Eppendorf biofotometro tikslumas yra ≤1,0% (1A). Tokių daugkartinių bandymų rezultatai svyruoja nuo maždaug 1,0% vidurkio ir yra normalūs. Be to, taip pat būtina atsižvelgti į pačios nukleino rūgšties fizikines ir chemines savybes ir buferio, kuriame yra ištirpinta nukleino rūgštis, pH, jonų koncentraciją ir tt: Kai per bandymą jonų koncentracija yra per didelė, skaitymo pamainomis, todėl rekomenduojama naudoti tam tikrą pH vertę ir mažą jonų koncentraciją. Buferiai, pvz., TE, labai stabilizuoja rodmenis. Mėginio praskiedimo koncentracija taip pat yra veiksnys, kurio negalima ignoruoti: dėl to, kad mėginyje yra neišvengiamų kai kurių smulkių dalelių, ypač nukleino rūgščių mėginių, buvimas. Šių mažų dalelių buvimas trukdo bandymų rezultatams. Siekiant sumažinti dalelių poveikį bandymo rezultatams, reikalaujama, kad nukleino rūgšties absorbcija būtų ne mažesnė kaip 0,1 A, o absorbcija yra geriau nuo 0,1 iki 1,5 A. Šiame diapazone turi būti trikdomas. dalelės yra palyginti mažos ir rezultatas yra stabilus.
Tai reiškia, kad mėginio koncentracija neturėtų būti per maža arba per didelė (už fotometro bandymų ribų). Galiausiai, veikimo veiksniai, tokie kaip maišymas, turėtų būti pakankami, priešingu atveju absorbcijos vertė yra per maža, net neigiamos vertės; mišinys negali egzistuoti burbuliukų, tuščias skystis neturi suspenduotų medžiagų, kitaip skaitymas smarkiai nukrenta; tą patį kiuvetę reikia naudoti tuščiajam ir mėginio bandymui. Kitaip koncentracijos skirtumas yra per didelis; konversijos koeficientas ir mėginio koncentracijos vienetas parenkami nuosekliai; negalima naudoti kiuvetės su langų nusidėvėjimu; mėginio tūris turi pasiekti mažiausią tūrį, kurio reikalauja kiuvetė.
Be nukleorūgšties koncentracijos, spektrofotometras taip pat rodo keletą labai svarbių santykių, rodančių mėginio grynumą, pavyzdžiui, santykį A 260 / A 280, naudojamą mėginio grynumui įvertinti, nes baltymo absorbcijos smailė yra 280 nm. Grynas mėginys, kurio santykis didesnis nei 1,8 (DNR) arba 2,0 (RNR). Jei santykis yra mažesnis nei 1,8 arba 2,0, tai rodo baltymų ar fenolinių medžiagų buvimą. A 230 rodo, kad mėginyje yra kai kurių teršalų, tokių kaip angliavandeniai, peptidai, fenoliai ir tt, o grynesnės nukleorūgšties A 260 / A 230 santykis yra didesnis nei 2,0. A 320 aptinka tirpalo drumstumą ir kitus trukdžių veiksnius. Gryniems mėginiams A 320 paprastai yra 0.
Hangzhou Sumer Instrument Co
Pridėti: No.168 Wuchang Ave., Yuhang rajonas, Hangzhou 310023, Kinija
TEL: + 86-571-88739859
Telefonas: +8618658504900
El. Paštas: info@sumerlab.com
Žiniatinklis: sumerinstrument.com