Spektrofotometrinis kolorimetrinis baltymų kiekybinis įvertinimas
Baltymai paprastai yra baltymų mišinys. Kolorimetriniai tyrimai yra pagrįsti baltymų sudedamosiomis dalimis: aminorūgštys (pvz., Tirozinas, serinas) reaguoja su papildoma chromogenine grupe arba dažais, kad pagamintų spalvotą medžiagą. Spalvotosios medžiagos koncentracija tiesiogiai susijusi su aminorūgščių, kurių baltymai reaguoja, skaičiumi, todėl atspindi baltymų koncentraciją.
Kolorimetrinis metodas
Yra keli metodai, tokie kaip BCA, Bradford ir Lowry.
"Lowry" metodas: remiantis ankstyviausia biureto reakcija ir pagerinta. Baltymai reaguoja su Cu2, kad susidarytų mėlyna reakcija. Tačiau Lowry metodas yra jautresnis nei biuretas. Trūkumas yra poreikis nuosekliai pridėti keletą skirtingų reagentų; reakcija trunka ilgą laiką; yra jautrus ne baltyminėms medžiagoms; baltymai, kurių sudėtyje yra EDTA, Triton x-100 ir amoniako sulfatas, netinka šiam metodui.
Bicinchoninino rūgšties tyrimas: tai nauja, jautresnė baltymų analizė. Analizuojamas baltymas reaguoja su Cu2 šarminiame tirpale, kad gautų Cu, kuris sudaro chelatą su BCA ir sudaro purpurinį junginį su absorbcijos smailiu esant 562 nm. Tiesinis ryšys tarp šio junginio ir baltymo koncentracijos yra stiprus, o junginys, susidaręs po reakcijos, yra labai stabilus. Atsižvelgiant į Lowry metodą, operacija yra paprastas ir jautrumas yra didelis. Tačiau, panašus į Lowry metodą, jis gali būti trikdomas baltymų ir ploviklių.
Bradfordo metodas: šio metodo principas yra tai, kad baltymas reaguoja su Coomassie Brilliant Blue, kad susidarytų spalvotas junginys, kuris sugeria 595 nm. Jo didžiausias bruožas yra jo jautrumas, kuris yra 2 kartus didesnis nei Lowry ir BCA. Tai paprasčiau ir greičiau. Reikia tik vieno tipo reakcijos reagento. Norint palengvinti rezultatą, junginys gali būti stabilus 1 valandą; Klaidėdamas Lowry, BCA reaguoja su reduktoriais (pvz., DTT, merkaptoetanolis). Tačiau jis vis dar yra jautrus plovikliams. Pagrindinis trūkumas yra tas, kad skirtingi standartai gali lemti didelius vieno ir to paties mėginio rezultatų skirtumus ir nėra panašių rezultatų.
Kai kurie tyrėjai, kurie pirmą kartą susiduria su kolorimetriniais matavimais, gali būti painiojami įvairių kolorimetrinių testų rezultatais. Kokie metodai, jūsų nuomone, yra painiojami? Atsižvelgiant į tai, kad grupės reagavo įvairiais būdais ir chromogeninės grupės nėra vienodos, tuo pačiu metu naudojami keli metodai, kad vienos ir to paties mėginio mėginio koncentracijos būtų nesuderintos. Pavyzdžiui, Keller ir kt. ištyrė baltymą motinos piene ir nustatė, kad Lowry ir BCA išmatuotos koncentracijos buvo žymiai didesnės nei Bradfordo. Skirtumas buvo reikšmingas. Net jei nustatomas tas pats pavyzdys, standartinis mėginys, pasirinktas tuo pačiu kolorimetriniu metodu, yra nenuoseklus, o koncentracija po bandymo taip pat yra nenuosekli. Pavyzdžiui, naudokite Lowry, kad baltymą patikrintumėte ląstelių homogenatuose, naudojant standartinį BSA, kurio koncentracija yra 1,34 mg / ml, ir standartinį globuliną, kurio koncentracija yra 2,64 mg / ml. Todėl prieš pasirenkant kolorimetrinį metodą, pageidautina nurodyti cheminę tiriamo mėginio sudėtį ir nustatyti chemiškai panašų standartinį baltymą. Be to, kolorimetrinis baltų kiekių nustatymo metodas dažnai sukelia problemų, nes mėginio absorbcinė vertė yra per maža, todėl didelis skirtumas tarp išmatuoto mėginio koncentracijos ir faktinės koncentracijos. Pagrindinis klausimas yra tas, kad svarbios 1011 spektrofotometro, kveeto dalies spalva turi tam tikrą pusėjimo trukmę, todėl kiekvienas kolorimetrinis metodas nurodo reakcijos bandymo laiką. Visi mėginiai (įskaitant standartinius mėginius) turi būti išbandyti per šį laiką. Jei laikas yra per ilgas, gauta absorbcijos vertė tampa mažesnė ir konvertuojamos koncentracijos vertė mažėja. Be to, visi reakcijos temperatūra, tirpalo pH vertė ir tt yra svarbūs veiksniai, kurie turi įtakos eksperimente. Be to, labai svarbu naudoti plastikinę kolorimetriją. Venkite naudoti kvarco iš kvarco arba stiklo, nes spalva po reakcijos sukels kvarcą ar stiklą, todėl bus netiksli mėginio absorbcija.
Įmonė specializuojasi spektrofotometrų pardavimo, pasveikinti klientus, kuriems reikia konsultuotis ir pirkti, mes suteiksime nuoširdų paslaugų ir kokybiškų produktų, taip pat mažesnes kainas.
El. Paštas: info@sumerlab.com
Interneto svetainė: sumerinstrument.com